Práctica 19: Seminograma.

1. Introducción.

Un seminograma es el estudio que se lleva a cabo de una muestra de semen con el fin de evaluar
su calidad seminal.

Esta prueba se realiza, a su vez, con un doble objetivo: el análisis cuantitativo que permite conocer
cuál es el volumen espermático o cantidad de esperma, además de la concentración y el número de
espermatozoides, y el análisis cualitativo que permite saber cómo es su viscosidad, color y otras
características.

Esta prueba es la primera con carácter diagnóstico que se lleva a cabo en tratamientos de repro-
ducción asistida y constituye la herramienta básica para detectar determinadas patologías o
cualquier alteración que pueda suponer un impedimento para el embarazo.

2. Materiales.

• Baño termostático.
• Incubadora.
• Microscopio óptico.
• Tubo de hemólisis.
• Colorante eosina-nigrosina.
• Solución de nigrosina.
• Portaobjetos y cubreobjetos.
• Cámara de Neubauer.
• Tiras reactivas de pH.
• Tubo cónico graduado.
• Pipetas Pasteur.
• Muestra de semen.
• Gradilla.

3. Procedimiento.

Tal cual recibamos la muestra la colocaremos dentro del baño termostático a 37ºC. Por otro lado,
colocamos 2 portaobjetos y cubreobjetos en la incubadora a 37ºC igualmente.

Comenzamos con el examen físico: valoramos la licuefacción, apariencia visual, color, viscosidad, volumen y pH.

La licuefacción y la viscosidad no se pueden datar debido a que la muestra ya se encontraba totalmente licuada, consecuencia de la transmisión de la muestra al laboratorio de período más largo de 30 minutos.

Para averiguar el volumen aspiramos el contenido del bote que contiene la muestra mediante una pipeta Pasteur estéril y lo vertemos en un tubo cónico graduado. Observamos dónde queda el menisco del líquido y lo anotamos dicha medición.

Respecto al pH, utilizaremos tiras reactivas de pH. Con la anterior pipeta colocamos una gota de la muestra de semen sobre una de las tiras reactivas y esperamos a que se produzca el cambio de color. Tras estabilizarse el color, lo comparamos con el patrón de pH que viene con las tiras.

Seguidamente se realiza un examen microscópico.

Examen en fresco: extraemos los portaobjetos de la incubadora. Con rapidez abrimos el tubo cónico y pipeteamos con la pipeta Pasteur el contenido para verter una gota en el portaobjetos, en el cual colocamos el cubreobjetos. Llevamos la preparación al microscopio y evaluamos la movilidad según la siguiente clasificación: movilidad progresiva rápida, movilidad progresiva lenta, movilidad no progresiva, inmóviles.

La vitalidad se averiguará realizando una tinción de eosina-nigrosina. En un tubo de hemólisis pipeteamos 2 gotas de esperma, cambiamos la pipeta Pasteur y pipeteamos otras 2 gotas del citado colorante. Esperamos 30 segundos y volvemos a pipetear 2 gotas de solución de nigrosina en el tubo. Agitamos con suavidad y lo llevamos al microscopio: aquellos que tengan la cabeza de color rojo significa que están muertos. Visualizamos diversos campos y anotamos cuántos hay vivos y muertos en cada uno, para más tarde hacer una regla de tres para traspasarlo a %.

Se deben de determinar anticuerpos antiespermáticos mediante pruebas de inmunocitoadherencia y tinción citomorfológica del semen (mediante tinción de Papanicolau), pero nosotros no lo realizamos porque no teníamos material.

Por último, la concentración espermática se calcula con la cámara de Neubauer.

4. Observaciones.

Todo el procedimiento hasta que lleguemos al cálculo de la concentración espermática debe de hacerse lo más rápido posible e intentando mantener una temperatura de 37º en el semen para que los espermatozoides no mueran. Es una muestra sensible que se debe analizar, como mucho, 30 minutos después de haber sido extraída.

Examen en fresco:

Tinción eosina-nigrosina:

5. Conclusiones.

Examen físico.

Volumen: 5’5 mL.

Color: normal.

Viscosidad: líquido.

pH: 8.

Exámen microscópico.

1. Movilidad:

1. Progresivos: 50%.
2. No progresivos: 50%.

2. Vitalidad.

1. Vivos: 27 (81’48%).
2. Muertos: 5 (18’52%).

6. Normas de seguridad y posibles peligros.

Estaremos atentos a que los objetivos del microscopio no topen con el mismo. El exceso de presión podrá romper el portaobjetos y echar a perder la práctica, además de provocar posibles fisuras en la lente del objetivo. Atenderemos al riesgo eléctrico de la toma de corriente del microscopio evitando que entren en contacto las manos o conductores eléctricos directamente con la toma. También evitaremos usarlo con las manos mojadas, sobre todo en la operación de enchufe y desenchufe, o la entrada de agua al sistema eléctrico. No ingerir ni tocar ninguna parte de la cara cuando se estén utilizando los colorantes. 

Práctica 18: análisis de drogas en saliva.

1. Introducción. 

El test se basa en un inmunoensayo cromatográfico de flujo lateral para la detección cualitativa de los siguientes parámetros en fluidos orales. Detecta niveles elevados de medicamentos específicos en saliva humana utilizando anticuerpos.

Esta técnica únicamente proporciona un resultado analítico preliminar, por lo que debe utilizarse un método adicional más específico con el fin de confirmar el resultado analítico.

2. Materiales.

• Test de saliva.
• Recolector de saliva (hisopo).
• Tubo de recolección con tapa de cuentagotas.
• Cronómetro.

3. Procedimiento.

Utilizando el colector o hisopo realizamos un barrido en el interior de la boca del paciente durante 3 minutos; la esponja deberá estar completamente blanda al terminar de recoger la muestra. 

Introducimos el colector dentro de la cavidad del tubo de recolección (tras abrir su tapón) y lo presionamos contra el filtro, de modo que se extraerá la mayor cantidad de muestra líquida posible. Cerramos la tapa del tubo y dejamos incubar 1 minuto a temperatura ambiente.

A continuación, sacamos el test del precinto cerrado y lo colocamos en una superficie limpia y plana. Abrimos el cuentagotas del tubo anterior, que daremos la vuelta y dejaremos caer 3 gotas de su interior sobre el test del dispositivo. Cerramos la tapa del dispensador y esperamos 10 minutos.

4. Observaciones.

El test proporciona un resultado preliminar y cualitativo, por lo que se debe utilizar un método analítico secundario para obtener un resultado confirmatorio. 

Un resultado negativo no indica necesariamente una muestra libre de droga, pues esta puede estar presente por debajo del umbral de detección del test.

5. Conclusiones.

Test negativo (-) en THC.

7. Normas de seguridad y posibles peligros.

Ningún hallazgo.

Práctica 17: determinación cuantitativa de creatinina.

1. Introducción.

La creatinina reacciona con el picrato alcalino formando un complejo rojizo. El intervalo de tiempo escogido para las lecturas permite eliminar gran parte de las interferencias conocidas del método.

La creatinina es el resultado de la degradación de la creatina, componente de los músculos y puede ser transformada en ATP, fuente de energía para las células. 

La producción de la creatinina depende de la modificación de la masa muscular. Su eliminación se realiza a través del riñón, por lo que una retención de creatinina en sangre (junto a urea y ácido úrico) es indicativo de insuficiencia renal progresiva.

2. Materiales.

• R1 (ácido pícrico).
• R2 (hidróxido sódico).
• Creatinine cal (patrón primario acuoso de creatinina).
• Muestra: suero heparinizado humano.
• Espectrofotómetro.
• 4 cubetas para espectrofotometría.
• Baño termostático.
• Micropipetas.
• Puntas para micropipeta.
• Tubo de ensayo.
• Agua destilada.
• Gradilla.

3. Procedimiento.

En primer lugar es necesario preparar el reactivo de trabajo a partir de los R1 y R2. Para obtenerlo tan solo diluiremos a partes iguales ambos reactivos en un tubo de ensayo y con la respectiva micropipeta al volumen necesario (necesitamos 3 ml, por lo que mezclando 2 ml de R1 con 2ml de R2 estaría bien).

Enchufamos el espectrofotómetro a la toma de corriente y lo encendemos. Ajustamos la longitud de onda (492 nm) y lo dejamos así hasta que lo utilicemos.

Colocamos 3 cubetas en el portacubetas y las etiquetamos como 'Blanco', 'Patrón' y 'Muestra'. 

A continuación transferimos con una pipeta de 1.000-5000 μL un volumen de 1 ml del reactivo de trabajo preparado anteriormente en las tres cubetas. Por otro lado, le añadiremos 100 μL de patrón (creatinine cal) a la cubeta Patrón y lo mezclamos.

Seguidamente llevamos las tres cubetas al baño termostático que  ajustaremos a 37ºC. Esperamos 10 minutos hasta que se atemperen; mientras tanto, ajustamos el espectrofotómetro a 0 frente a agua destilada (cubeta con agua destilada).

Una vez lleguen a dicha temperatura, llevamos las cubetas cerca del aparato y taramos en blanco de reactivo. Con rapidez, pipeteamos 100 μL de la muestra (suero) en la cubeta de 'Muestra', la mezclamos, la colocamos en el espectrofotómetro y ponemos en marcha el cronómetro.

Al cabo de 30 y 90 segundos leemos las absorbancias (A1 y A2). Repetimos el mismo proceso con la cubeta 'Patrón' (pero sin pipetear la muestra).

4. Observaciones.

5. Conclusiones.
Blanco: 0 A.
Blanco Muestra: 0 A.
Patrón: 0'344 A ; 0'300 A.
Muestra: 0'730 A ; 0'760 A.

Los valores normales son:

Hombres 0,7 - 1,4 mg/dL. 

Mujeres 0,6 - 1,1 mg/dL.

El paciente tiene la creatinina alta. Esto puede suceder cuando existe un consumo de fármacos o suplementos alimenticios que dañan los riñones, provocando enfermedades renales; o bien cuando existe un exceso ejercicio.

6. Normas de seguridad y posibles peligros.

Atenderemos al riesgo eléctrico de la toma de corriente del espectrofotómetro y el baño termostático evitando que entren en contacto las manos o conductores eléctricos directamente con la toma. También evitaremos usarlo con las manos mojadas, sobre todo en la operación de enchufe y desenchufe, o la entrada de agua al sistema eléctrico. No se mira directamente a la llama ni a las fuentes de emisión (lámparas).

Evitaremos la entrada de líquido al sistema por colocar la micropipeta en horizontal o al revés, así como no usar punta de micropipeta. Podrían ocasionar la contaminación y rotura de la micropipeta.
Comprobar el nivel de agua destilada del baño termostático: debe estar lleno, pero sin tocar las tapas superiores.

Práctica 16: LDH

1. Introducción.

La lactato deshidrogenasa (LDH) cataliza la reducción del piruvato por el NADH, según la siguiente reacción:

La velocidad de disminución de la concentración de NADH en el medio determinado fotométricamente es proporcional a la concentración catalítica de LDH en la muestra ensayado.

La LDH es una enzima distribuida por todo el organismo humano.
El nivel de la misma en suero está elevado en pacientes con enfermedades de hígado, infartos de miocardio, alteraciones renales, distrofias musculares y anemias.


2. Materiales.

• Baño termostático.
• Gradilla.
• Pinzas.
• 3 tubos de ensayo.
• Micropipetas.
• Puntas para micropipetas.
• Espectrofotómetro.
• Agua destilada.
• 2 cubetas de espectrofotometría.
• Portacubetas.
• Reactivos: R1, R2.
• Muestra de plasma.

3. Procedimiento.

Primeramente colocaremos el tubo de ensayo en una gradilla, la cual llevaremos al baño termostático que ajustaremos a 37ºC.

Mientras tanto preparamos el reactivo de trabajo: abrimos el tapón del reactivo R2 y vertemos el comprimido de su interior en el vial R1. Tapamos y mezclamos suavemente hasta disolver su contenido.

A continuación, enchufamos a la toma de corriente el espectrofotómetro y lo ajustamos a 340 nm de longitud de onda. Pipeteamos en el tubo de ensayo anterior 3 ml de RT y 50 μL del la muestra contenida en un Eppendorf, y mezclamos hasta homogeneizarlo al completo. Este líquido es el que tendremos que medir, -tras ajustar a 0 el espectrofotómetro frente a agua destilada- por lo que transferiremos con la micropipeta 1 ml del mismo a la cubeta restante.

La lectura se iniciará en el minuto 0, así que anotaremos su absorbancia tal cual coloquemos la cubeta y pondremos el marcha el cronómetro. Leeremos las absorbancias en los minutos 1, 2 y 3.

Finalmente realizamos los cálculos del promedio del incremento de absorbancia por minuto.

4. Observaciones.

La práctica no se puede realizar correctamente debido a que el espectrofotómetro no mantiene la temperatura idónea (37º) de necesita la enzima para catalizar la reacción.

5. Conclusiones.

6. Normas de seguridad y posibles peligros.

Atenderemos al riesgo eléctrico de la toma de corriente del espectrofotómetro evitando que entren en contacto las manos o conductores eléctricos directamente con la toma.
También evitaremos usarlo con las manos mojadas, sobre todo en la operación de enchufe y desenchufe, o la entrada de agua al sistema eléctrico. No se mira directamente a la llama ni a las fuentes de emisión (lámparas).

Evitaremos la entrada de líquido al sistema por colocar la micropipeta en horizontal o al revés, así como no usar punta de micropipeta. Podrían ocasionar la contaminación y rotura de la micropipeta.

Práctica 15: Deterinación hemoglobina A1c.

1. Introducción.

La prueba de hemoglobina glicosilada (HbA1c) es un examen de sangre para la diabetes tipo 2 y prediabetes. Mide el nivel promedio de glucosa o azúcar en la sangre durante los últimos tres meses. Los médicos pueden usar la prueba HbA1c sola o en combinación con otras pruebas de diabetes para hacer un diagnóstico. También utilizan la HbA1c para ver lo bien que está manejando su diabetes. Esta prueba es diferente a los controles de azúcar en la sangre que las personas con diabetes se hacen todos los días.

El resultado de su prueba HbA1c se entrega en porcentajes. Mientras más alto sea el porcentaje, mayor es su nivel de azúcar en la sangre

2. Materiales.

• Micropipetas.
• Puntas para micropipetas.
• Gradilla.
• Hemoglobina glicosilada 1 y 2 (R1 y R2)
• Agua destilada.
• 2 tubos de ensayo.
• Muestra de sangre total con EDTA o heparinizada.
• 2 tubos de ensayo de 5 ml.
• 2 tubos de ensayo de 10 ml.
• Portacubetas.
• 3 cubetas de espectrofotometría.

3. Procedimiento. 

En primer lugar enchufamos el espectrofotómetro a la toma de corriente y lo encendemos. Lo ajustamos a 415 nm.

En un tubo de ensayo colocado en la gradilla pipeteamos 50 μl de sangre total con EDTA o heparinizada, al cual le adicionaremos 200 μl de R1 con otra micropipeta. Desechamos ambas puntas y le colocamos un tapón al tubo de ensayo para agitarlo posteriormente con el fin de producir hemólisis.

A continuación, tenemos que dejar preparada la columna: destapamos la misma y le extraemos su parte inferior, bajamos el disco hasta que toque la resina y dejamos gotear en un tubo de ensayo. 

Cuando deje de gotear desechamos el eluído e introducimos mediante una micropipeta 50 μl del hemolizado anterior en la parte superior de la columna. Nuevamente se deja gotear y, cuando termine, desechamos el eluído para volver a pipetear 200 μl de R2 en la columna.

Tras seguir esperando, desechamos el eluído y adicionamos 2 mL de R2 y repetimos el mismo proceso.

Cambiamos la columna a otro tubo de ensayo vacío y pipeteamos en la parte de arriba de la misma 4 mL de R3, cuyo eluído recogeremos y mediremos su absorbancia ya que se trata de la HbAlc.

En otro tubo de ensayo diferente pipeteamos 12 mL de R3 y le añadimos 50 μl del hemolizado del que partimos. Taponamos el tubo y agitamos para medir su absorbancia (es la Ahb total).

Colocamos las tres cubetas en el portacubetas, en las cuales verteremos 1 ml de agua destilada, 1 ml de HbAlc y 1 ml de Ahb total sucesivamente. Las medimos en el espectrofotómetro y anotamos sus absorbancias.

4. Observaciones.

No podemos dejar que la columna se seque.
La columna debe estar colocada en una posición recta para que el eluido pase por ella más rápido.

5. Conclusiones.

• BLANCO: 0.
• AHbA1c: 0,390 A.
• AHb total: 1,091 A.

(AHbA1c / (3 x Ahb total) ) x 100

Resultado: 11,91 %

Los valores normales se encuentran 4,2-6,2 %. El resultado es tan alto porque es posible que los reactivos estuviesen caducados, la sangre muy degradada o no se han respetado las condiciones de temperatura óptimas.

6. Normas de seguridad y posibles peligros.

tenderemos al riesgo eléctrico de la toma de corriente del espectrofotómetro evitando que entren en contacto las manos o conductores eléctricos directamente con la toma.
También evitaremos usarlo con las manos mojadas, sobre todo en la operación de enchufe y desenchufe, o la entrada de agua al sistema eléctrico. No se mira directamente a la llama ni a las fuentes de emisión (lámparas).

Evitaremos la entrada de líquido al sistema por colocar la micropipeta en horizontal o al revés, así como no usar punta de micropipeta. Podrían ocasionar la contaminación y rotura de la micropipeta.