Práctica 15: Deterinación hemoglobina A1c.

1. Introducción.

La prueba de hemoglobina glicosilada (HbA1c) es un examen de sangre para la diabetes tipo 2 y prediabetes. Mide el nivel promedio de glucosa o azúcar en la sangre durante los últimos tres meses. Los médicos pueden usar la prueba HbA1c sola o en combinación con otras pruebas de diabetes para hacer un diagnóstico. También utilizan la HbA1c para ver lo bien que está manejando su diabetes. Esta prueba es diferente a los controles de azúcar en la sangre que las personas con diabetes se hacen todos los días.

El resultado de su prueba HbA1c se entrega en porcentajes. Mientras más alto sea el porcentaje, mayor es su nivel de azúcar en la sangre

2. Materiales.

• Micropipetas.
• Puntas para micropipetas.
• Gradilla.
• Hemoglobina glicosilada 1 y 2 (R1 y R2)
• Agua destilada.
• 2 tubos de ensayo.
• Muestra de sangre total con EDTA o heparinizada.
• 2 tubos de ensayo de 5 ml.
• 2 tubos de ensayo de 10 ml.
• Portacubetas.
• 3 cubetas de espectrofotometría.

3. Procedimiento. 

En primer lugar enchufamos el espectrofotómetro a la toma de corriente y lo encendemos. Lo ajustamos a 415 nm.

En un tubo de ensayo colocado en la gradilla pipeteamos 50 μl de sangre total con EDTA o heparinizada, al cual le adicionaremos 200 μl de R1 con otra micropipeta. Desechamos ambas puntas y le colocamos un tapón al tubo de ensayo para agitarlo posteriormente con el fin de producir hemólisis.

A continuación, tenemos que dejar preparada la columna: destapamos la misma y le extraemos su parte inferior, bajamos el disco hasta que toque la resina y dejamos gotear en un tubo de ensayo. 

Cuando deje de gotear desechamos el eluído e introducimos mediante una micropipeta 50 μl del hemolizado anterior en la parte superior de la columna. Nuevamente se deja gotear y, cuando termine, desechamos el eluído para volver a pipetear 200 μl de R2 en la columna.

Tras seguir esperando, desechamos el eluído y adicionamos 2 mL de R2 y repetimos el mismo proceso.

Cambiamos la columna a otro tubo de ensayo vacío y pipeteamos en la parte de arriba de la misma 4 mL de R3, cuyo eluído recogeremos y mediremos su absorbancia ya que se trata de la HbAlc.

En otro tubo de ensayo diferente pipeteamos 12 mL de R3 y le añadimos 50 μl del hemolizado del que partimos. Taponamos el tubo y agitamos para medir su absorbancia (es la Ahb total).

Colocamos las tres cubetas en el portacubetas, en las cuales verteremos 1 ml de agua destilada, 1 ml de HbAlc y 1 ml de Ahb total sucesivamente. Las medimos en el espectrofotómetro y anotamos sus absorbancias.

4. Observaciones.

No podemos dejar que la columna se seque.
La columna debe estar colocada en una posición recta para que el eluido pase por ella más rápido.

5. Conclusiones.

• BLANCO: 0.
• AHbA1c: 0,390 A.
• AHb total: 1,091 A.

(AHbA1c / (3 x Ahb total) ) x 100

Resultado: 11,91 %

Los valores normales se encuentran 4,2-6,2 %. El resultado es tan alto porque es posible que los reactivos estuviesen caducados, la sangre muy degradada o no se han respetado las condiciones de temperatura óptimas.

6. Normas de seguridad y posibles peligros.

tenderemos al riesgo eléctrico de la toma de corriente del espectrofotómetro evitando que entren en contacto las manos o conductores eléctricos directamente con la toma.
También evitaremos usarlo con las manos mojadas, sobre todo en la operación de enchufe y desenchufe, o la entrada de agua al sistema eléctrico. No se mira directamente a la llama ni a las fuentes de emisión (lámparas).

Evitaremos la entrada de líquido al sistema por colocar la micropipeta en horizontal o al revés, así como no usar punta de micropipeta. Podrían ocasionar la contaminación y rotura de la micropipeta.