Práctica 16: LDH

1. Introducción.

La lactato deshidrogenasa (LDH) cataliza la reducción del piruvato por el NADH, según la siguiente reacción:

La velocidad de disminución de la concentración de NADH en el medio determinado fotométricamente es proporcional a la concentración catalítica de LDH en la muestra ensayado.

La LDH es una enzima distribuida por todo el organismo humano.
El nivel de la misma en suero está elevado en pacientes con enfermedades de hígado, infartos de miocardio, alteraciones renales, distrofias musculares y anemias.


2. Materiales.

• Baño termostático.
• Gradilla.
• Pinzas.
• 3 tubos de ensayo.
• Micropipetas.
• Puntas para micropipetas.
• Espectrofotómetro.
• Agua destilada.
• 2 cubetas de espectrofotometría.
• Portacubetas.
• Reactivos: R1, R2.
• Muestra de plasma.

3. Procedimiento.

Primeramente colocaremos el tubo de ensayo en una gradilla, la cual llevaremos al baño termostático que ajustaremos a 37ºC.

Mientras tanto preparamos el reactivo de trabajo: abrimos el tapón del reactivo R2 y vertemos el comprimido de su interior en el vial R1. Tapamos y mezclamos suavemente hasta disolver su contenido.

A continuación, enchufamos a la toma de corriente el espectrofotómetro y lo ajustamos a 340 nm de longitud de onda. Pipeteamos en el tubo de ensayo anterior 3 ml de RT y 50 μL del la muestra contenida en un Eppendorf, y mezclamos hasta homogeneizarlo al completo. Este líquido es el que tendremos que medir, -tras ajustar a 0 el espectrofotómetro frente a agua destilada- por lo que transferiremos con la micropipeta 1 ml del mismo a la cubeta restante.

La lectura se iniciará en el minuto 0, así que anotaremos su absorbancia tal cual coloquemos la cubeta y pondremos el marcha el cronómetro. Leeremos las absorbancias en los minutos 1, 2 y 3.

Finalmente realizamos los cálculos del promedio del incremento de absorbancia por minuto.

4. Observaciones.

La práctica no se puede realizar correctamente debido a que el espectrofotómetro no mantiene la temperatura idónea (37º) de necesita la enzima para catalizar la reacción.

5. Conclusiones.

6. Normas de seguridad y posibles peligros.

Atenderemos al riesgo eléctrico de la toma de corriente del espectrofotómetro evitando que entren en contacto las manos o conductores eléctricos directamente con la toma.
También evitaremos usarlo con las manos mojadas, sobre todo en la operación de enchufe y desenchufe, o la entrada de agua al sistema eléctrico. No se mira directamente a la llama ni a las fuentes de emisión (lámparas).

Evitaremos la entrada de líquido al sistema por colocar la micropipeta en horizontal o al revés, así como no usar punta de micropipeta. Podrían ocasionar la contaminación y rotura de la micropipeta.