Práctica 5: Refractometría.

1. Introducción.

La refractometría de líquidos es una técnica analítica que determina la densidad de una disolución en base a la modificación que dicha densidad induce en su índice de refracción. Dicho índice de refracción indica la desviación de la dirección inicial del rayo luminoso al pasar la luz de un medio aéreo a uno líquido, pudiéndose averiguar con él la densidad de dicho líquido.

Para llevarla a cabo se necesita de un instrumento óptico denominado refractómetro, que mide el ángulo de refracción de la luz al atravesar un líquido a una temperatura determinada.

2. Materiales.

• Refractómero.
• Muestra líquida de suero, plasma u orina.
• Agua destilada. 
• Papel absorbente.
• Pipeta Pasteur.

3. Procedimiento.

Primero se debe de calibrar el instrumento colocando una gota de agua destilada en el prisma del refractómetro, se cierra su tapa y, mirando por el ocular, se hace una puesta a cero moviendo el tornillo.

Tras el taraje limpiamos el agua con papel absorbente y colocamos una gota de la muestra problema (suero, plasma, orina) en el prisma; cerramos la tapa y, mirando por el ocular, determinaremos su concentración de proteínas o electrolitos (densidad).

4. Normas de seguridad y posibles peligros.

Se debe evitar las ralladuras sobre el prisma y/o golpes o caídas que podrían dañar el sistema óptico, ya que estas tienen una influencia negativa en la medición.

En la limpieza se utiliza solo un paño húmedo o papel absorbente y se evitarán limpiadores agresivos, secándose perfectamente el aparato con suaves toques.

El instrumento se limpiará simplemente con un paño húmedo y nunca bajo el agua, ya que podría penetrar en el interior y dañarlo.

5. Observaciones.

Ninguna observación a destacar.

7. Conclusiones.

Conseguimos calibrar el refractómetro entre toda la clase sin problema.

Práctica 8: Determinación cuantitativa de proteínas totales.

1. Introducción.

Las proteínas son compuestos orgánicos macromoleculares ampliamente distribuidos en el organismo que actúan como elementos estructurales y de transporte. Se dividen en dos fracciones: albumina y globulinas. Su detección es útil para detectar hiperproteinemias ( hemoconcentración, deshidratación o aumento en la concentración de proteínas específicas) o hipoproteinemias ( hemodilución por defectos en la síntesis proteica, hemorragias o catabolismo proteico excesivo).

En esta práctica mediremos las proteínas totales a partir de la intensidad de color formado, el cual es proporcional a la concentración de las mismas. Dicho color lo dan las proteínas cuando están en un medio alcalino en presencia de sales de cobre y yoduro como antioxidante.

2. Materiales.

• Reactivos: R, T protein call.
• Patrón.
• Muestra.
• Micropipeta de 1.000 μL y 25 μL.
• Puntas de micropipeta.
• 4 cubetas de espectrofotometría.
• Portacubetas.

3. Procedimiento.

El procedimiento es sencillo: colocamos las cubetas de espectrofotometría en el portacubetas y llenamos una de agua destilada. El resto los etiquetamos con las iniciales 'B' (Blanco), 'P' (Patrón) y 'M' (Muestra).

En las tres pipeteamos 1.000  μL del RT; no obstante, en el P pipeteamos 25 μL de Patrón y en la M, 25 μL de muestra de plasma.

Dejamos incubar las tres cubetas 10 minutos a temperatura ambiente.

Pasado dicho tiempo, encendemos el espectrofotómetro e introducimos la longitud de onda a la que vamos a medir: 540 nm. Ajustamos a 0 con la cubeta de agua destilada y nuevamente lo repetimos con la cubeta B; una vez así, introduciremos las dos cubetas restantes, una a una, y anotamos sus resultados correspondientes. 

B- 0.

M- 0'553.

P- 0'528.

A partir de los resultados aplicaremos la fórmula para averiguar la concentración:

4. Normas de seguridad y posibles peligros.

Atenderemos al riesgo eléctrico de la toma de corriente del espectrofotómetro evitando que entren en contacto las manos o conductores eléctricos directamente con la toma. También evitaremos usarlo con las manos mojadas, sobre todo en la operación de enchufe y desenchufe, o la entrada de agua al sistema eléctrico. No se mira directamente a la llama ni a las fuentes de emisión (lámparas).
Evitaremos la entrada de líquido al sistema por colocar la micropipeta en horizontal o al revés, así como no usar punta de micropipeta. Podrían ocasionar la contaminación y rotura de la micropipeta.
En cuanto a los reactivos, R provoca quemaduras graves en la piel y lesiones oculares graves, además de ser nocivo para organismos acuáticos. Trabajaremos con el con los EPIs necesarios.

5. Observaciones.

Los valores de referencia de la concentración de proteínas en plasma son, para los adultos, entre 6'6-8'3 g/dl.

6. Conclusiones.

El sujeto se encuentra dentro de los valores normales de concentración de proteínas totales en plasma, por lo que no posee ninguna patología asociada.

Práctica 7: Colesterol total y triglicéridos.

1. Introducción.

Los triglicéridos son grasas que suministran energía a la célula. Al igual que el colesterol, son transportadas a las células del organismo por las lipoproteínas en la sangre. El aumento de los mismos es diversamente inespecífico: disfunciones hepáticas, diabetes mellitus, etc.

El colesterol es una sustancia grasa presente en todas las células del organismo. El hígado produce naturalmente todo el colesterol que necesita para formar las membranas celulares y producir ciertas hormonas. La determinación del colesterol es una de las herramientas más importantes para el diagnóstico y clasificación de lipemias, además de que su aumento es uno de los principales factores de riesgo cardiovascular.

2. Materiales.

TRIGLICÉRIDOS.

• 4 cubetas de espectrofotometría.
• Portacubetas.
• Varilla.
• Reactivos: tampón (R1), enzimas (R2) y triglicéridos CAL.
• Patrón.
• Muestra de plasma.
• Micropipetas de 1000 y 10 μL.
• Puntas de micropipeta.
• Espectrofotómetro.
• Gradilla.

COLESTEROL.

• 4 cubetas de espectrofotometría.
• Portacubetas.
• Varilla.
• Reactivos: tampón (R1), enzimas (R2), cholesterol cal.
• Patrón.
• Muestra de plasma. 
• Micropipetas de 1000 y 10 μL.
• Puntas de micropipeta.
• Espectrofotómetro.
• Gradilla.

3. Procedimiento.

TRIGLICÉRIDOS.

Preparación del RT: en primer lugar machacaremos la pastilla de enzimas (R1) dentro de su propio vial presionando una y otra vez con la varilla de vidrio. Éste polvo lo pasaremos al vial del tampón (R2) y homogeneizamos la disolución moviendo circularmente.

Colocamos las cubetas de espectrofotometría en el portacubetas y llenamos una de agua destilada. El resto los etiquetamos con las iniciales 'B' (Blanco), 'P' (Patrón) y 'M' (Muestra).

En las tres pipeteamos 1.000  μL del RT; no obstante, en el P pipeteamos 10 μL de Patrón y en la M, 10 μL de muestra de plasma.

Dejamos incubar las tres cubetas 10 minutos a temperatura ambiente.

Pasado dicho tiempo, encendemos el espectrofotómetro e introducimos la longitud de onda a la que vamos a medir: 505 nm. Ajustamos a 0 con la cubeta de agua destilada y nuevamente lo repetimos con la cubeta B; una vez así, introduciremos las dos cubetas restantes, una a una, y anotamos sus resultados correspondientes. 

B- 0.

M- 0'309.

P- 0'311.

A partir de los resultados aplicaremos la fórmula para averiguar la concentración:

COLESTEROL.

Preparación del RT: lo realizamos igual que con los triglicéridos.
El procedimiento es el mismo que el anterior pero con distintos reactivos.

Obtenemos:
B- 0.
M- 0'404.
P- 0'255.

Los cálculos son:

4. Normas de seguridad y posibles peligros.

Atenderemos al riesgo eléctrico de la toma de corriente del espectrofotómetro evitando que entren en contacto las manos o conductores eléctricos directamente con la toma. También evitaremos usarlo con las manos mojadas, sobre todo en la operación de enchufe y desenchufe, o la entrada de agua al sistema eléctrico. No se mira directamente a la llama ni a las fuentes de emisión (lámparas).

Además, tendremos que examinar el estado de las piezas de vidrio antes de utilizarlas y desechar las que presenten el más mínimo defecto, así como desechar el material que haya sufrido un golpe de cierta consistencia -aunque no se observen grietas o fracturas- para prevenir cortes con el material. 
Evitaremos la entrada de líquido al sistema por colocar la micropipeta en horizontal o al revés, así como no usar punta de micropipeta. Podrían ocasionar la contaminación y rotura de la micropipeta.

5. Observaciones.

Los valores de referencia de los triglicéridos en hombres es de 40-160 mg/dL; y de mujeres, 35-135 mg/dL.

Los valores de referencia del colesterol son:
Normal: <200mg/dL.
Moderado: 200-239 mg/dL.
Alto: >240 mg/dL.

6. Conclusiones.

El sujeto, -tanto si es hombre como mujer- tiene los triglicéridos (198'71 mg/dL) y el colesterol (316'86 mg/dL) altos.

Práctica 6: Cromatografía en capa fina.

1. Introducción.

La cromatografía engloba a aquellas técnicas de separación de solutos en disolventes basadas en las diferentes afinidades que muestran dichos solutos por dos fases distintas denominadas móvil y estacionaria.
En la cromatografía en capa fina, el soporte utilizado también es plano y consiste en una capa muy fina de partículas (fase estacionaria) situadas sobre una lámina de vidrio, plástico o aluminio. La fase móvil es un líquido adecuado a las sustancias a separar. El mecanismo de separación es la adsorción: interacciones de tipo electrostático, puentes de hidrógeno y Fuerzas de Van der Waals entre los solutos y las fases móvil y estacionaria, permitiendo que los solutos se fijen en la superficie de la fase estacionaria. 

2. Materiales.

• Láminas de gel de celulosa.
• Disolvente de cromatografía.
• Disolución reveladora (ninhidrina en acetona 0'2%).
• Muestra problema de aminoácidos en Eppendorf (leucina, alanina y glicina).
• Disolución de aminoácidos control en Eppendorf.
• Gradilla.
• Vidrio de reloj.
• Vaso de precipitado de 250 ml.
• Micropipeta de 10
• Puntas de micropipeta.
• Disolución de fase móvil.
• Lápiz.
• Regla

3. Procedimiento.

Dibujaremos en la lámina de gel de celulosa con el lápiz sin apretar una línea a 1'5 cm de distancia de la base,  ayudándonos de la regla. En dicha línea marcaremos dos puntos, los cuales estarán separados a 1 cm de distancia.

Una vez ambos Eppendorfs en la gradilla, abrimos el de Control y trasferimos una gota del mismo al punto de más a la izquierda. Desechamos la punta y colocamos otra para colocar otra gota en el punto de la derecha, pero ésta vez de la Muestra.

Dejamos secar ambas gotas. Cuando sea así, volvemos a colocar las gotas de la misma manera que realizamos anteriormente y dejamos secar de nuevo.

Finalmente dejamos caer disolvente de cromatografía en un vaso de precipitado, de modo que llegue aproximadamente a un dedo de distancia con respecto a a superficie del vidrio. Colocamos en el vaso la anterior lámina, estando la línea en contacto con el disolvente.

Dejamos reposar el tiempo que sea necesario para que el disolvente, la muestra y el reactivo ascienda por capilaridad.

Para poder observar los resultados, secaremos la lámina cuando el frente de solvente llegue hasta la parte superior y la rociaremos disolución reveladora.

Con la regla, medimos el frente del disolvente y las distancias desde la línea hasta el punto medio de cada aminoácido (en la muestra). Apuntamos resultados.

4. Observaciones.

La distancia desde la línea hasta el punto medio de cada aminoácido es de 1'2 cm y 4 cm; por otro lado, la distancia del frente de solvente es de 6'5 cm.
Por tanto, la relación al frente del solvente (Rf) es...

5. Conclusiones.

Nuestros compañeros realizaron una cromatografía en tres puntos con los aminoácidos arginina, fenilalanina y ácido glutámico aislados con el objetivo de ser comparada con las láminas que llevan la muestra. Al relacionar su lámina control con la lámina de la muestra (la nuestra) observamos que la primera mancha se trataba del aminoácido arginina (el de 1'2 cm) y la segunda, la fenilalanina (el de 4 cm). Por tanto se concluye que en la muestra no hay presencia de ácido glutámico.

6. Normas de seguridad y posibles peligros.

No tocaremos sin guantes la lámina de celulosa, ya que las partículas que contienen son tóxicas. 
Además, rociaremos la ninhidrina en un lugar abierto, con guantes y mascarilla debido a su alta capacidad para irritar ojos y piel, a una distancia no muy lejos de la lámina y realizando una primera pulverización de prueba lejos de cualquier contacto a alguien.

Práctica 4: Turbidimetría.

1. Introducción.

La turbidimetría consiste en la medición de la disminución de la intensidad de un haz de luz indicente al atravesar una suspensión de partículas capaz de dispersar el haz. Así pues, esta atenuación se produce gracias a los fenómenos de absorción y dispersión que experimenta la luz debido a las partículas por lo que este método es un tipo de espectrofotometría de dispersión y el aparato de laboratorio que lo lleva a cabo se denomina turbidímetro.

2. Materiales.

• 9 tubos de ensayo de 10 ml. 
  
  
• 4 tubos de ensayo de 13 ml. 
  
  
• Muestra de orina en tubo cónico de 13 ml. 
  
  
• 7 cubetas de espectrofotometría. 
  
  
• Portacubetas. 
  
  
• Puntas de micropipeta de distintos tamaños. 
  
  
• Micropipetas de distintos volúmenes. 
  
  
• Suero salino 0'9%.
  
  
• Agua destilada.
  
  
• Patrón de proteína. 
  
  
• Albúmina bovina.
  
  
• Ácido sulfosalicílico.
  
  
• Vaso de precipitado. 
  
  
• Pipeta de 10 ml. 
  
  
• Auxiliar de pipeteo. 
  
  
• Pipeta Pasteur. 
  
  
• 2 gradillas. 
  
  

3. Procedimiento. 

En primer lugar centrifugaremos la muestra de orina a 2.000 rpm durante 5 minutos. Cuando termine, extraemos con la pipeta Pasteur el sobrenadante y lo llevamos a un tubo de ensayo que etiquetaremos como 'orina'. 

Preparación de los reactivos D1, D2, D3 y D4. 

Antes de comenzar la preparación del contenido de las cubetas, necesitamos los reactivos D1, D2, D3 y D4 que los contendrán. 

Colocaremos cuatro tubos de ensayo de 13 ml en una gradilla y los etiquetaremos con sus respectivos nombres. Los reactivos tendrán que tener lo siguiente:

	D1	D2	D3	D4
Patrón de proteína (mL)	0'2	0'1	0'05	0'025
Solución salina (mL)	9'8	9'9	9'95	9'97
Concentración (mg/dL)	140	70	35	17'5

A partir de estos tubos prepararemos otros 7 tubos de ensayo, los cuales contendrán:

	BR	P1	P2	P3	P4	BM	PB
Suero salino fisiológico	0’5
D1		0’5
D2			0’5
D3				0’5
D4					0’5
Orina						0’5	0’5
Ácido sulfosalicílico	2’0	2’0	2’0	2’0	2’0		2’0

La muestra que depositamos en el tubo PB es el sobrenadante de la orina que hemos centrifugado anteriormente junto a una gota de albúmina bovina.

Una vez tengamos todos los tubos, transferimos cada uno a su correspondiente cubeta y medimos en el espectrofotómetro cada una de ellas a una longitud de onda de 660 nm, dentro de la región visible.

BR	0’17
P1	0’767
P2	0’319
P3	0’092
P4	0’035
BM	0
PB	0’989

4. Preguntas.

1. Representa la gráfica de los tubos P1-4

Para poder representar la gráfica debemos averiguar las concentraciones de cada tubo:

P1: 140mg/dl x 0,5 ml= ? x 2,5 ml -> ?= 28 mg/dl.

P2: 70 mg/dl x 0,5 ml= ? x 2,5 ml -> ?= 14 mg/dl.

P3: 35 mg/dl x 0,5 ml= ? x 2,5 ml -> ?= 7 mg/dl.

P4: 17,5 mg/dl x 0,5 ml= ? x 2,5 ml -> ?= 3,5 mg/dl.

Para averiguar la concentración de la muestra comparamos la absorbancia y la concentración de uno de los tubos que conocemos con la absorbancia de la muestra.

Por tanto: 0,767 A/ 0,989A = 28 mg/dl / ?

?= 36,10 mg/dl

Una vez tenemos todas las concentraciones representamos la gráfica:

2. ¿Por qué vemos turbidez?¿Qué hace el equipo con ella?

El equipo lo que hace es la disminución de la intensidad del haz de luz provocado por las grandes partículas que conforman la disolución.

5. Normas de seguridad y posibles peligros.

Atenderemos al riesgo eléctrico de la toma de corriente del espectrofotómetro evitando que entren en contacto las manos o conductores eléctricos directamente con la toma. También evitaremos usarlo con las manos mojadas, sobre todo en la operación de enchufe y desenchufe, o la entrada de agua al sistema eléctrico. No se mira directamente a la llama ni a las fuentes de emisión (lámparas). Además, tendremos que examinar el estado de las piezas de vidrio antes de utilizarlas y desechar las que presenten el más mínimo defecto, así como desechar el material que haya sufrido un golpe de cierta consistencia -aunque no se observen grietas o fracturas- para prevenir cortes con el material. 

Evitaremos la entrada de líquido al sistema por colocar la micropipeta en horizontal o al revés, así como no usar punta de micropipeta. Podrían ocasionar la contaminación y rotura de la micropipeta.

6. Observaciones.

Ninguna observación a destacar.

7. Conclusiones.

La concentración de la muestra es de 36'10 mg/dl.