Práctica 3: Determinación de glucemia (glucosa TR).

1. Introducción.

La glucosa oxidasa (GOD) cataliza la oxidación de glucosa a ácido glucónico, formándose además peróxido de hidrógeno. En presencia de la enzima POD, el peróxido de hidrógeno forma quinona (cromóforo) y agua gracias a un aceptor cromogénico denominado quinona. La quinona producirá un color, cuya intensidad proporcional a la concentración de glucosa de la muestra a ensayar.

 El aumento de glucosa en sangre significa que el páncreas no segrega correctamente insulina, una sustancia que introduce glucosa en las células para realizar sus procesos vitales. Esta patología se denomina diabetes mellitus. 

2. Materiales. 

● Reactivos: patrón, muestra de suero y RT (preparado en la práctica 2). 

● 4 cubetas de espectrofotometría. 

● Portacubetas. 

● Agua destilada. 

● Espectrofotómetro. 

● Micropipeta de 10 microlitros. 

● Micropipeta de 1.000microlitros. 

3. Procedimiento. 

Para aplicar la fórmula que nos averigua los mg/el en sangre necesitamos averiguar la absorbancia de la muestra, el patrón y el blanco. Por tanto, llenaremos tres cubetas con lo siguiente:

Colocadas en el portacubetas, comenzaremos pipeteando 1 ml de RT a cada cubeta con la micropipeta de 1.000 microlitros y su correspondiente punta, teniendo en cuenta que tendremos que cambiar de punta cada vez que cambiemos de cubeta.

Los 10 microlitros de patrón solo los verteremos en la cubeta 2, cambiando a la micropipeta fija de 10 microlitros.

Cuando el patrón esté listo, desechamos la punta y le colocamos otra nueva para trasvasar 10 microlitros desde eppendorf con suero sanguíneo (abriendolo y sujetándolo con una mano mientras la otra está ocupada con la micropipeta) hasta la cubeta 3. Desechamos la punta.

Homogeneizamos las mezclas de cada cubeta con la micropipeta de 1.000 microlitros ajustada alrededor de 400microlitros, presionando hasta el primer tope y aflojando el émbolo continuadas veces estando la punta dentro de cada líquido. Desecharemos cada punta al cambiar de cubeta para evitar futuras interferencias. A continuación, dejaremos incubar las cubetas a temperatura ambiente durante 20 minutos. Tras esperar, llevamos las cubetas al espectrofotómetro y tardamos a 0 el aparato con una cubeta llena de agua destilada. Introducimos la longitud de onda (505 nm) y comenzamos la medición introduciendolas una a una y apuntando sus absorbancias.

Averiguadas las absorbancias ya podemos aplicar la fórmula:

4. Normas de seguridad y posibles peligros.

Atenderemos al riesgo eléctrico de la toma de corriente del espectrofotómetro evitando que entren en contacto las manos o conductores eléctricos directamente con la toma. También evitaremos usarlo con las manos mojadas, sobre todo en la operación de enchufe y desenchufe, o la entrada de agua al sistema eléctrico. No se mira directamente a la llama ni a las fuentes de emisión (lámparas).

Además, tendremos que examinar el estado de las piezas de vidrio antes de utilizarlas y desechar las que presenten el más mínimo defecto, así como desechar el material que haya sufrido un golpe de cierta consistencia -aunque no se observen grietas o fracturas- para prevenir cortes con el material.

No usar los reactivos en caso de estar caducados. Los viales se conservan a 2-8º.
Evitaremos la entrada de líquido al sistema por colocar la micropipeta en horizontal o al revés, así como no usar punta de micropipeta. Podrían ocasionar la contaminación y rotura de la micropipeta.

5. Observaciones.

Los valores de referencia de la glucosa en plasma o suero son entre 60-110 mg/dl.

6. Conclusiones.

El paciente tiene  279’ 32 mg/dl de glucosa en sangre estando el máximo del intervalo del valor de referencia en 110 mg/dl, por lo que estamos ante una hiperglucemia. En conclusión, el sujeto es diabético.