1. Introducción.
La hexokinasa (HK) es una enzima que cataliza la fosforilación de la glucosa por ATP a
glucosa-6-fosfato (G6F). La glucosa-6-fosfato originada es reducida a 6-fosfogluconato en presencia de
la enzima glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa (GSF-DH), produciéndose a la misma vez una reducción de
NAD a NADH. Por tanto, el aumento en la concentración de NADH en el medio quiere decir que ha
aumentado la glucosa.
El aumento de glucosa en sangre significa que el páncreas no segrega correctamente insulina, una
sustancia que introduce glucosa en las células para realizar sus procesos vitales. Esta patología se
denomina diabetes mellitus.
2. Materiales.
● Reactivos: glucosa HK, tampón, patrón y muestra.
● Espectrofotómetro.
● 4 cubetas.
● Portacubetas.
● Micropipeta de 10 microlitros.
● Micropipeta de 1.000 microlitros.
● Puntas de micropipeta.
● Agua destilada.
● Pipeta Pasteur.
● Punta de micropipeta de 5μL.
3. Procedimiento.
Preparación del RT.
Primeramente crearemos el reactivo de trabajo a partir de la glucosa HK y el tampón.
Dentro del vial de glucosa HK hay una 'pastilla' que se compone por enzimas. Esta pastilla la
tendremos que machacar dentro del propio bote ejerciendo presión con la punta de micropipeta
de 5μL hasta que sea polvo, que será cuando la vertamos directamente al vial del tampón.
Volteamos el vial con cuidado y lo dejamos en la mesa. Abrimos el tapón y sacamos un
volumen inespecífico de el con la pipeta Pasteur para transferirlo al vial de las enzimas con el
objetivo de recoger los restos que se pudieran quedar en él. Una vez así, llevamos el líquido al
vial del tampón.
Ya está listo nuestro reactivo de trabajo.
Medición en el espectrofotómetro.
Tendremos que realizar 3 disoluciones en tres cubetas distintas y llenar una cubeta de agua
destilada (para tarar). El contenido de las cubetas debe ser:
Colocamos las cubetas en el porta cubetas y comenzaremos pipeteando el reactivo de
trabajo (RT) con la micropipeta de 1.000 microlitros. Le colocaremos su correspondiente punta
y la introduciremos en el RT, donde presionaremos el émbolo hasta el primer tope antes de
entrar en el líquido y soltaremos una vez dentro hasta que se llene. Sacamos la punta y
presionamos hasta el 2º émbolo en la cubeta nº1 (Blanco). Repetiremos el mismo proceso
-desechando las puntas- con todas las cubetas.
Llevamos el portacubetas cerca del espectrofotómetro y taramos el mismo con la cubeta de
agua destilada, introduciéndola en el y presionando el botón 'medir blanco' hasta que salga
0'00A. Sacamos la cubeta y comenzamos la medición: introducimos la cubeta 1, la 2 y la 3
sucesivamente, y apuntamos las absorbancias de cada una.
Averiguadas las absorbancias ya podremos aplicar la fórmula:
4. Normas de seguridad y posibles peligros.
Atenderemos al riesgo eléctrico de la toma de corriente del espectrofotómetro evitando que
entren en contacto las manos o conductores eléctricos directamente con la toma. También
evitaremos usarlo con las manos mojadas, sobre todo en la operación de enchufe y desenchufe, o
la entrada de agua al sistema eléctrico.
No se mira directamente a la llama ni a las fuentes de emisión (lámparas).
Además, tendremos que examinar el estado de las piezas de vidrio antes de utilizarlas y
desechar las que presenten el más mínimo defecto, así como desechar el material que haya
sufrido un golpe de cierta consistencia -aunque no se observen grietas o fracturas- para prevenir
cortes con el material.
No usar los reactivos en caso de estar caducados.
Los viales se conservan a 2-8º.
5. Observaciones.
Hubieron dificultades para machacar la pastilla de enzimas.
Los valores de referencia de la glucosa en plasma o suero son entre 60-110 mg/dl.
6. Conclusiones.
El suero es de un paciente diabético debido a que supera el límite de los valores de
referencia con creces.
6. Conclusiones.
El suero es de un paciente diabético debido a que supera el límite de los valores de
referencia con creces.
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