Práctica 3: Determinación de glucemia (glucosa TR).

1. Introducción.

La glucosa oxidasa (GOD) cataliza la oxidación de glucosa a ácido glucónico, formándose además peróxido de hidrógeno. En presencia de la enzima POD, el peróxido de hidrógeno forma quinona (cromóforo) y agua gracias a un aceptor cromogénico denominado quinona. La quinona producirá un color, cuya intensidad proporcional a la concentración de glucosa de la muestra a ensayar.

 El aumento de glucosa en sangre significa que el páncreas no segrega correctamente insulina, una sustancia que introduce glucosa en las células para realizar sus procesos vitales. Esta patología se denomina diabetes mellitus. 

2. Materiales. 

● Reactivos: patrón, muestra de suero y RT (preparado en la práctica 2). 

● 4 cubetas de espectrofotometría. 

● Portacubetas. 

● Agua destilada. 

● Espectrofotómetro. 

● Micropipeta de 10 microlitros. 

● Micropipeta de 1.000microlitros. 

3. Procedimiento. 

Para aplicar la fórmula que nos averigua los mg/el en sangre necesitamos averiguar la absorbancia de la muestra, el patrón y el blanco. Por tanto, llenaremos tres cubetas con lo siguiente:

Colocadas en el portacubetas, comenzaremos pipeteando 1 ml de RT a cada cubeta con la micropipeta de 1.000 microlitros y su correspondiente punta, teniendo en cuenta que tendremos que cambiar de punta cada vez que cambiemos de cubeta.

Los 10 microlitros de patrón solo los verteremos en la cubeta 2, cambiando a la micropipeta fija de 10 microlitros.

Cuando el patrón esté listo, desechamos la punta y le colocamos otra nueva para trasvasar 10 microlitros desde eppendorf con suero sanguíneo (abriendolo y sujetándolo con una mano mientras la otra está ocupada con la micropipeta) hasta la cubeta 3. Desechamos la punta.

Homogeneizamos las mezclas de cada cubeta con la micropipeta de 1.000 microlitros ajustada alrededor de 400microlitros, presionando hasta el primer tope y aflojando el émbolo continuadas veces estando la punta dentro de cada líquido. Desecharemos cada punta al cambiar de cubeta para evitar futuras interferencias. A continuación, dejaremos incubar las cubetas a temperatura ambiente durante 20 minutos. Tras esperar, llevamos las cubetas al espectrofotómetro y tardamos a 0 el aparato con una cubeta llena de agua destilada. Introducimos la longitud de onda (505 nm) y comenzamos la medición introduciendolas una a una y apuntando sus absorbancias.

Averiguadas las absorbancias ya podemos aplicar la fórmula:

4. Normas de seguridad y posibles peligros.

Atenderemos al riesgo eléctrico de la toma de corriente del espectrofotómetro evitando que entren en contacto las manos o conductores eléctricos directamente con la toma. También evitaremos usarlo con las manos mojadas, sobre todo en la operación de enchufe y desenchufe, o la entrada de agua al sistema eléctrico. No se mira directamente a la llama ni a las fuentes de emisión (lámparas).

Además, tendremos que examinar el estado de las piezas de vidrio antes de utilizarlas y desechar las que presenten el más mínimo defecto, así como desechar el material que haya sufrido un golpe de cierta consistencia -aunque no se observen grietas o fracturas- para prevenir cortes con el material.

No usar los reactivos en caso de estar caducados. Los viales se conservan a 2-8º.
Evitaremos la entrada de líquido al sistema por colocar la micropipeta en horizontal o al revés, así como no usar punta de micropipeta. Podrían ocasionar la contaminación y rotura de la micropipeta.

5. Observaciones.

Los valores de referencia de la glucosa en plasma o suero son entre 60-110 mg/dl.

6. Conclusiones.

El paciente tiene  279’ 32 mg/dl de glucosa en sangre estando el máximo del intervalo del valor de referencia en 110 mg/dl, por lo que estamos ante una hiperglucemia. En conclusión, el sujeto es diabético.

Práctica 2: Determinación cuantitativa de glucosa HK.

1. Introducción. 

La hexokinasa (HK) es una enzima que cataliza la fosforilación de la glucosa por ATP a glucosa-6-fosfato (G6F). La glucosa-6-fosfato originada es reducida a 6-fosfogluconato en presencia de la enzima glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa (GSF-DH), produciéndose a la misma vez una reducción de NAD a NADH. Por tanto, el aumento en la concentración de NADH en el medio quiere decir que ha aumentado la glucosa. 

El aumento de glucosa en sangre significa que el páncreas no segrega correctamente insulina, una sustancia que introduce glucosa en las células para realizar sus procesos vitales. Esta patología se denomina diabetes mellitus. 

2. Materiales. 

● Reactivos: glucosa HK, tampón, patrón y muestra. 

● Espectrofotómetro. 

● 4 cubetas. 

● Portacubetas. 

● Micropipeta de 10 microlitros. 

● Micropipeta de 1.000 microlitros. 

● Puntas de micropipeta. 

● Agua destilada. 

● Pipeta Pasteur. 

● Punta de micropipeta de 5μL. 

3. Procedimiento. 

Preparación del RT. 

Primeramente crearemos el reactivo de trabajo a partir de la glucosa HK y el tampón. Dentro del vial de glucosa HK hay una 'pastilla' que se compone por enzimas. Esta pastilla la tendremos que machacar dentro del propio bote ejerciendo presión con la punta de micropipeta de 5μL hasta que sea polvo, que será cuando la vertamos directamente al vial del tampón. Volteamos el vial con cuidado y lo dejamos en la mesa. Abrimos el tapón y sacamos un volumen inespecífico de el con la pipeta Pasteur para transferirlo al vial de las enzimas con el objetivo de recoger los restos que se pudieran quedar en él. Una vez así, llevamos el líquido al vial del tampón. Ya está listo nuestro reactivo de trabajo.

Medición en el espectrofotómetro.

Tendremos que realizar 3 disoluciones en tres cubetas distintas y llenar una cubeta de agua destilada (para tarar). El contenido de las cubetas debe ser: 

Colocamos las cubetas en el porta cubetas y comenzaremos pipeteando el reactivo de trabajo (RT) con la micropipeta de 1.000 microlitros. Le colocaremos su correspondiente punta y la introduciremos en el RT, donde presionaremos el émbolo hasta el primer tope antes de entrar en el líquido y soltaremos una vez dentro hasta que se llene. Sacamos la punta y presionamos hasta el 2º émbolo en la cubeta nº1 (Blanco). Repetiremos el mismo proceso -desechando las puntas- con todas las cubetas.

Nuevamente pipetearemos 10 μL con la otra micropipeta desde el patrón hasta la cubeta 2 y cambiaremos la punta para transferir otros 10 μL de muestra a la cubeta 3. Finalmente llenamos la cubeta sobrante con agua destilada.

Llevamos el portacubetas cerca del espectrofotómetro y taramos el mismo con la cubeta de agua destilada, introduciéndola en el y presionando el botón 'medir blanco' hasta que salga 0'00A. Sacamos la cubeta y comenzamos la medición: introducimos la cubeta 1, la 2 y la 3 sucesivamente, y apuntamos las absorbancias de cada una.

 

Averiguadas las absorbancias ya podremos aplicar la fórmula:

4. Normas de seguridad y posibles peligros. 

Atenderemos al riesgo eléctrico de la toma de corriente del espectrofotómetro evitando que entren en contacto las manos o conductores eléctricos directamente con la toma. También evitaremos usarlo con las manos mojadas, sobre todo en la operación de enchufe y desenchufe, o la entrada de agua al sistema eléctrico. 

No se mira directamente a la llama ni a las fuentes de emisión (lámparas). Además, tendremos que examinar el estado de las piezas de vidrio antes de utilizarlas y desechar las que presenten el más mínimo defecto, así como desechar el material que haya sufrido un golpe de cierta consistencia -aunque no se observen grietas o fracturas- para prevenir cortes con el material. 

No usar los reactivos en caso de estar caducados. 

Los viales se conservan a 2-8º. 

5. Observaciones. 

Hubieron dificultades para machacar la pastilla de enzimas. Los valores de referencia de la glucosa en plasma o suero son entre 60-110 mg/dl. 6. Conclusiones. El suero es de un paciente diabético debido a que supera el límite de los valores de referencia con creces.

6. Conclusiones. 

El suero es de un paciente diabético debido a que supera el límite de los valores de referencia con creces.

Práctica 1: Medición de la absorbancia de un banco de diluciones.

1. Introducción.

El espectrofotómetro es un instrumento con el que se apoya la espectrofotometría para medir la cantidad de intensidad de luz absorbida después de pasar a través de una solución muestra. Es usado en el análisis químico para medir, en función de la longitud de onda, la relación entre valores de una misma magnitud fotométrica relativos a dos haces de radiaciones y la concentración o reacciones químicas que se miden en una muestra. También se utiliza en laboratorios de química para la cuantificación de sustancias y microorganismos. 

2. Objetivo. 

Preparar dos bancos de 5 diluciones seriadas: una de una disolución madre con 5 ml de azul de metileno en 50 ml de agua destilada y otro de una disolución madre con 2 ml de rojo ponceau en 100 ml de agua destilada, ambos con factor de dilución ½ y volumen final 4 ml. Medir la absorbancia de todas las disoluciones de azul de metileno a 660 nm, realizar una curva de calibración a mano y un espectro de absorción. Medir la absorbancia de todas las disoluciones de rojo ponceau y obtener un espectro de absorción.

3. Materiales. 

● Micropipeta 100-1000 μl 

● Puntas de micropipeta. 

● Portacubetas. 

● 11 cubetas de espectrofotometría. 

● Rotulador permanente. 

● 10 tubos de ensayo. 

● 2 disoluciones madre de azul de metileno y rojo ponceau. 

● Gradilla. 

● Pipetas de 2ml. 

● Auxiliar de pipeteo o pera.  

4. Procedimiento. 

BANCOS DE DILUCIONES. 

En primer lugar procedemos a realizar los cálculos necesarios para averiguar el volumen de paso.

• Banco con azul de metileno.

Del matraz con la disolución madre pipeteamos 6 ml con una pipeta y los llevamos a un tubo de ensayo, el cual será el tubo 1. Comenzaremos las diluciones vertiendo 2 ml de agua destilada en los tubos 2-4 y seguidamente pipeteamos de nuevo otros 2 ml del tubo 1 para transferirlos al tubo de ensayo nº2; mezclamos el 2 y volvemos a aspirar 2 ml que llevaremos al tubo de ensayo nº 3 y así sucesivamente con todos hasta llegar al 5. En el tubo 5 se aspiran 2 ml de la dilución para desecharlos.

• Banco con rojo ponceau.

 Repetimos el proceso anterior pero con el matraz de la disolución de rojo ponceau.

  MEDICIÓN DE LA ABSORBANCIA EN EL ESPECTROFOTÓMETRO. 

En primer lugar rotulamos las cubetas y los tubos de ensayo, teniendo en cuenta que serán del 1 al 5 para el azul de metileno e igualmente con el rojo ponceau. 

Pipeteamos 1.000 μl (o 1 ml) con la micropipeta tras colocarle la punta adecuada, transfiriendo pues dicha cantidad desde los tubos de ensayo a su correspondiente cubeta. Cambiaremos de punta cada vez que pasemos a otro número para evitar variaciones de concentración debido a los restos de solución que se pudieran quedar en ella. Repetiremos el mismo proceso con la disolución madre de rojo ponceau.

 Medición del banco de azul de metileno: taramos el espectrofotómetro con el blanco, (cubeta con 1.000 microlitros de agua destilada) colocándolo en el interior del espectrofotómetro con la flecha de la cubeta hacia delante, y cerramos la tapa. Presionamos el botón ‘ajustar nm’, tecleamos 660 (longitud de onda que se absorberá en el caso del azul de metileno) y presionamos la tecla ‘medir blanco’. El espectrofotómetro ya está tarado, por lo que podremos retirar el blanco del mismo. Comenzamos a introducir las disoluciones del banco, comenzando por la disolución madre: abrimos la tapa, introducimos la cubeta con la solución madre, cerramos y esperamos a que salga resultados. Anotamos aquello que veamos en la pantalla y sacamos la cubeta; volvemos a repetir el proceso con la cubeta 1, 2, 3 y 4.

A partir de las absorbancias, dibujamos una curva de calibración; es decir, una representación gráfica en un eje de coordenadas de absorbancia frente a concentración. Antes necesitamos pasar las concentraciones de los tubos (ya que son las mismas que las de las cubetas) a mg/dl y realizar una tabla comparándolas con las absorbancias:

Por otro lado, visualizaremos el espectro de absorción. Sacamos todas las cubetas y metemos el Blanco, presionamos la tecla ‘Blanco’ y después la de ‘barrido de exploración’; ahí tecleamos el intervalo 600-700 nm (el intervalo de la longitud de onda absorbida por el color complementario azul) y presionaremos la tecla ‘medir línea base’. Metemos la cubeta nº5 (pues es la más diluida) y le damos a ‘medir muestra’. Éste fue el resultado.

• Medición del banco de rojo ponceau: en éste caso solo mediremos las cubetas 3 y 4 ya que la disolución madre (1) y 2 tendrán concentraciones muy altas y no cumplirán el límite de linealidad. Antes tendremos que averiguar a cuántos nm medir la absorbancia del rojo ponceau; como ya hemos visto en el tema, el color complementario rojo absorbe en el intervalo 495 y 505 nm. Presionamos la tecla ‘Blanco’ y después la de ‘barrido de exploración’; ahí tecleamos el intervalo 495-505 nm y le damos a ‘medir línea base’. Metemos la cubeta nº5 y volvemos a comprimir la tecla ‘medir muestra’. Para nuestra sorpresa, éste fue el resultado.

En la gráfica no se puede interpretar nada debido a que el intervalo es demasiado pequeño. Es decir, en el intervalo solo hay 10 longitudes de onda por lo que no se extraen resultados concluyentes. Por tanto, volvemos a intentarlo pero con un intervalo de longitudes algo más amplio: 450 y 550.

Presionamos 'Tabular' y nos saldrá en tabla:

5. Normas de seguridad y posibles peligros.

Atenderemos al riesgo eléctrico de la toma de corriente del espectrofotómetro evitando que entren en contacto las manos o conductores eléctricos directamente con la toma. También evitaremos usarlo con las manos mojadas, sobre todo en la operación de enchufe y desenchufe, o la entrada de agua al sistema eléctrico.

No se mira directamente a la llama ni a las fuentes de emisión (lámparas). Además, tendremos que examinar el estado de las piezas de vidrio antes de utilizarlas y desechar las que presenten el más mínimo defecto, así como desechar el material que haya sufrido un golpe de cierta consistencia -aunque no se observen grietas o fracturas- para prevenir cortes con el material. 

Evitaremos la entrada de líquido al sistema por colocar la micropipeta en horizontal o al revés, así como no usar punta de micropipeta. Podrían ocasionar la contaminación y rotura de la micropipeta.

6. Observaciones.

Al contrario de lo que hemos visto y explicado en toda la práctica, hubo una equivocación y llegamos a la conclusión de que el tubo 1 no es la disolución madre. Dicho de otra forma, la disolución madre se encuentra en el matraz y en el tubo 1 ya se comienzan a diluir 2ml de la disolución madre + 2 mL de agua destilada (no se le pipetean 6ml de la disolución madre) por lo que habríamos de aplicarle el factor de dilución y en consecuencia, todas las concentraciones son erróneas. Las cubetas solo se pueden coger por los lados que poseen rayas, de tal forma que el rayo de luz pase por la zona plana de la cubeta.

7. Conclusiones.

El valor de longitud de onda del color rojo debe corresponder al máximo de absorbancia, el cual es 0’093 A y su longitud de onda es 522 nm.